Hasta los años ‘90, el ARN parecía tener un papel secundario en la historia de la biología celular. Su rol aparentaba limitarse a llevar un mensaje, desde el escenario del ADN hasta el de las proteínas. EL ADN, con su función directiva, daba órdenes de lo que debía ocurrir en la célula. Y las proteínas, protagonistas, llevaban a cabo todas las “actividades” celulares.
Ahora se sabe que esta historia no es exactamente así. Se ha demostrado que el ARN, al igual que el ADN, puede dar órdenes (porta un mensaje en sí mismo) y también cumple otras funciones muy importantes en la célula, que exceden al papel de mensajero.
Entre otras cosas, se ha descripto un mecanismo mediante el cual el ARN regula la expresión de ciertas regiones del ADN, y define qué proteínas estarán presentes en la célula. Este mecanismo de regulación de la expresión génica se conoce como Silenciamiento génico.
Dogma central de la Biología
El científico inglés Francis Crick, famoso por proponer junto a James Watson un modelo de estructura para el ADN (ver cuaderno nº 32, 100) y por ganar el Premio Nobel en 1962 por ese trabajo, también enunció el dogma central de la biología (ver cuaderno nº 3). Este concepto fundamental propone que la información genética fluye del ADN al ARN y luego a las proteínas (ver Figura 1). Cuando en una célula se requiere la síntesis de una proteína específica, la porción de ADN que la codifica será copiada en forma de ARN, mediante el proceso de transcripción. Luego el ARN formado, que se denomina ARN mensajero, es utilizado como molde para la síntesis de proteínas por el mecanismo de traducción. Son finalmente las proteínas quienes llevan a cabo la mayor parte de las actividades celulares. Hoy en día se sabe que este dogma presenta algunas excepciones (ARN con actividad catalítica, virus con un genoma formado por ARN, etc.)
Figura 1.
Regulación de la expresión génica
Absolutamente todas las células que componen un organismo contienen la misma información genética en su ADN (ver cuaderno nº 3). Un ser humano adulto está compuesto por aproximadamente 100 billones (millones de millones) de células. El núcleo de cada una de ellas contiene un total de dos metros de ADN (súper condensado y enrollado) con 30.000 genes en su secuencia. Sin embargo, no todos los genes se expresan en todas las células, ni lo hacen todo el tiempo, ni durante el mismo período. Es esa expresión diferencial de genes la que define que en un mismo organismo existan muchos tipos celulares. Por ejemplo, una célula nerviosa posee la misma información genética que una célula muscular del mismo organismo (ver Figura 2). Pero ¿cómo puede ser que estos dos tipos celulares difieran tanto en estructura y función? Esto se debe a que existen mecanismos de regulación de la expresión génica que definen qué genes se expresan y en qué momento en cada tipo celular. Se podría decir que, en diferentes tipos celulares, hay genes que están “encendidos” o “activos”, mientras que otros están “apagados” o “inactivos”, y esto determina las características que expresa la célula.
Decir que un gen está “encendido” o “activo” significa que, a partir de ese gen, se está transcribiendo el ARNm (mensajero) que a su vez dirigirá la síntesis de la proteína correspondiente. Como representa la Figura 2, en la célula muscular tanto el gen A como el gen B están “encendidos”. Mientras que en la célula nerviosa, el gen B está “apagado”. Es decir que la proteína B no estará presente en la célula nerviosa. Evidentemente, el gen B determina una característica que está presente en la célula muscular, pero está ausente en las neuronas.
Figura 2.
Rol de la expresión génica en la diferenciación celular. Fuente: ArgenBio
El Silenciamiento génico
En la célula existen muchas formas de regular la expresión génica, es decir, de “prender” o “apagar” algún gen. El silenciamiento génico constituye una de esas maneras. A continuación se detallan algunas características de este proceso:
Es un mecanismo celular mediante el cual se inhibe la expresión de genes.
Controla la expresión de genes endógenos y exógenos.
Presenta un papel importante en la regulación del desarrollo, en la diferenciación celular y en la defensa contra genes de organismos invasores (foráneos) y transposones.
Puede ocurrir tanto en el núcleo como en el citoplasma de la célula.
Puede regular en la etapa de transcripción y de traducción.
El ARN doble cadena suele ser la señal de activación del mecanismo de silenciamiento génico.
Hasta el momento se ha demostrado que el Silenciamiento génico ocurre en:
Plantas.
Algas unicelulares.
Hongos.
Nematodos (C. elegans).
La mosca de la fruta (Drosophila melanogaster).
Células de mamíferos.
La represión de la expresión de los genes mediante el silenciamiento génico puede ocurrir a dos niveles: transcripcional y post-transcripcional, tal como se muestra en la siguiente Figura 3.
Nivel de acción del silenciamiento transcripcional (TGS) y post-transcripcional (PTGS). Fuente: ArgenBio
El silenciamiento génico transcripcional
(TGS, en inglés “Transcriptional Gene Silencing”).
Ocurre en el núcleo de la célula. Mediante el TGS se inhibe la síntesis de ARNm, es decir, no ocurre la transcripción. En este caso, los genes están silenciados por modificaciones a nivel de ADN, que implican su metilación (adición de un grupo metilo -CH3 a una molécula) o remodelamiento. Se propone que el incremento de metilación del ADN induce, posiblemente, la formación de heterocromatina, es decir, zonas de ADN de alta densidad que impiden el acceso de la “maquinaria transcripcional” y que por ende los genes no se expresan.
En cambio, en el Silenciamiento Génico Postranscripcional (PTGS por su traducción en ingles “Post-Transcriptional Gene Silencing”), sí hay transcripción del gen silenciado. Lo que ocurre es que el ARN mensajero sintetizado es degradado de forma específica, en función de su secuencia. En este caso tampoco habrá síntesis proteica del gen que esta siendo “silenciado”.
Las primeras investigaciones en el área proponían que el TGS y el PTGS eran fenómenos independientes. Sin embargo, se encontraron mas tarde evidencias en algunos virus y transgenes que inducían ambos procesos, sugiriendo que se trata de dos mecanismos alternativos pero no excluyentes de regulación de la expresión génica
Mecanismo molecular del silenciamiento génico transcripcional (TGS)
Muchos de los detalles bioquímicos del silenciamiento génico todavía no fueron determinados con exactitud para los diferentes organismos en los que fue descripto este mecanismo. Además, las etapas de este proceso no son conservadas en todos las especies sino que las vías presentan diferencias. Sin embargo, tal como se conoce hoy en día, el silenciamiento génico ocurre de acuerdo a ciertos principios conservados (ver Figura 4 en la página siguiente):
Mecanismo molecular de silenciamiento génico post-transcipcional.
Fuente: ArgenBio
La primera etapa involucra la presencia un ARN doble cadena (ARNdc)
Regiones del ARNdc son reconocidas de manera específica por su secuencia. El complejo proteico que lleva a cabo dicho reconocimiento se denomina DICER
DICER cataliza la degradación del ARNdc, formando moléculas de ARN de menor longitud (21-26 nucleótidos).
Estos ARN pequeños de doble cadena se unen a otro complejo proteico, llamado RISC.
Una de las dos hebras de las moléculas de ARN pequeñas es eliminada.
La otra hebra permanece unida al complejo RISC, sirviendo de molde para el reconocimiento especifico de ARN mensajeros con la misma secuencia.
El ARN mensajero reconocido, es degradado. Por ende, no habrá síntesis de proteína a partir del ARN mensajero que fue reconocido por el complejo RISC. De esta forma, el gen que codifica para el ARNm fue silenciado.
En conclusión, el mecanismo de silenciamiento génico garantiza que la presencia de ARNdc gatillará la degradación de ARN mensajero con secuencia semejante. Al ser hidrolizado, el ARNm ya no podrá oficiar de molde durante la síntesis proteica. Por lo que no habrá producto proteico a partir del gen que codifica para dicho ARNm, es decir, se “silenció” la expresión de dicho gen.
En eucariotas, existen cientos de genes en el genoma que codifican para moléculas de ARN pequeñas que al ser expresadas adquieren estructura de doble cadena. Estas moléculas de ARN doble cadena activan a la maquinaria del silenciamiento génico, regulando la expresión de genes endógenos en eucariotas.
A diferencia de los seres humanos y otros vertebrados que han desarrollado complejos sistemas inmunes como defensa a infecciones de microorganismos, en organismos más primitivos que carecen de un sistema inmune eficiente, se ha demostrado que el silenciamiento génico resulta ser un importante mecanismo para la protección de infecciones virales. ¿Cómo ocurre esta defensa? La información genética de algunos virus consiste en ARN doble cadena y muchos otros virus, que son de ARN simple cadena, poseen en alguna etapa de su ciclo reproductivo ARN doble cadena. Una infección viral comienza cuando el ARN del virus entra en la célula. Entonces, el ARN se une al complejo DICER, y es fragmentado en moléculas más pequeñas. Esto activa al complejo RISC, por lo que el ARN viral es degradado y la célula infectada sobrevive a la infección. En plantas y en algunos gusanos como pC. elegans (Caenorhabditis elegans), pel silenciamiento se inicia localmente pero puede expandirse hacia otros lugares del organismo. A este mecanismo se lo denomina psilenciamiento sistémicop. Hasta el momento, la señal que amplifica al silenciamiento no ha sido identificada, pero se postula que la misma debe ser algún tipo de ARN (o al menos alguna molécula que tenga algún componente de ARN), de manera tal de asegurar la especificidad de secuencia.
Primeras voces del silenciamiento Los primeros indicios del mecanismo de silenciamiento génico fueron observados a principios de los años 90. En ese entonces, los resultados fueron muy difíciles de explicar. Un grupo de investigadores que trabajaban en rutas de biosíntesis de pigmentos en flores, buscaban intensificar el color rojo de las flores de petunia. Para lograr su objetivo, introdujeron una copia adicional de un gen involucrado en la síntesis de pigmentos rojos mediante Ingeniería Genética (ver Cuaderno nº 4). El resultado no fue el esperado: obtuvieron flores blancas en lugar de las de color rojo intenso que esperaban. Figura 5.
Por otro lado, investigadores de Inglaterra, lograron proteger a plantas de infecciones virales al introducirles genes del mismo virus causante de la enfermedad. Hasta ese momento, resultaba muy difícil explicar las observaciones.
En febrero de 1998, los investigadores Andrew Fire y Craig Mello publicaron sus descubrimientos en la revista científica Nature respecto del trabajo que realizaban en regulación de la expresión génica del gusano C. elegans. Los investigadores buscaban un modo eficiente de silenciar genes como estrategia para estudiar su función en el desarrollo de este nematodo. Estos resultados clarificarían los resultados contradictorios obtenidos anteriormente en petunias, hongos y plantas infectadas con virus.
El experimento crucial consistió en introducir, mediante inyecciones, ARN del gen unc-22, implicado en el proceso de contracción muscular. Al inyectar el ARN mensajero simple cadena, no se obtenía ningún efecto visible, y la contracción muscular de los gusanos era normal. Sin embargo, al inyectar ARN doble cadena, los gusanos presentaban grandes espasmos, tal como también ocurría en aquellos gusanos que carecían del gen unc-22.
En esta publicación, Fire y Mello demostraron que es posible el silenciamiento específico de un gen mediante la introducción en la célula de ARNdc con secuencia homóloga al gen. Además, proponen que este fenómeno es mediado por un mecanismo endógeno natural, que tiene como consecuencia la degradación del ARNm y que es usado por la célula para controlar la expresión génica. Finalmente, sugieren una conexión entre este mecanismo y el fenómeno descrito en plantas.
Este trabajo logró una excepcional repercusión en la comunidad científica, valiéndoles a Fire y Mello el premio NOBEL en Fisiología y Medicina en 2006.
Aplicaciones del silenciamiento génico en Biotecnología
Además de las funciones naturales del silenciamiento génico, el uso de este mecanismo como herramienta en biotecnología abre la puerta a nuevas posibilidades, permitiendo el “apagado” de genes de manera selectiva.
Se pueden introducir moléculas de ARN en células u organismos completos, desencadenando la degradación del ARNm homólogo y, de esta forma, silenciando la expresión de un determinado gen. Esta técnica puede ser aplicada en diferentes áreas, biotecnología en plantas, fisiología animal, medicina, estudio de nuevas drogas, etc.
Aplicaciones del silenciamiento génico en Biotecnología Vegetal
En plantas superiores, el silenciamiento génico mediado por ARN es un mecanismo adaptativo que induce la formación de defensas antivirales sistémicas, en respuesta a la exposición a un virus. Además, se están desarrollando plantas genéticamente modificadas, en las que se introducen construcciones que darán origen a moléculas de ARN doble cadena, capaces de inhibir la expresión de genes endógenos de manera selectiva y con algún fin determinado. Existen numerosos desarrollos biotecnológicos en los que se ha incrementado la calidad de alimentos por silenciamiento génico: plantas de café con contenido reducido de cafeína en grano, maíz con mayor valor nutricional en su componente proteico, mandioca con un 99% menos de laminarían (compuesto que en el tracto digestivo genera cianuro, altamente tóxico), entre muchos otros.
Otro ejemplo de mejoramiento por silenciamiento de genes, es el desarrollo de papas con menores niveles del aminoácido asparragina en tubérculo. Algunos alimentos procesados contienen pequeñas cantidades de acrilamida, una sustancia que puede resultar tóxica para el sistema nervioso. La acrilamida se forma en alimentos que contienen almidón (harina de trigo, papas, etc.) cuando se hornean o fríen. La industria alimenticia busca bajar los niveles de acrilamida en sus productos. Se han desarrollado plantas de papa transgénicas con menores niveles del aminoácido asparragina en tubérculo a través del silenciamiento génico. Las papas fritas hechas a partir de estas papas contienen hasta 20 veces menos de acrilamida que las papas de plantas no genéticamente modificadas.
Además, se ha logrado mejorar el rendimiento y calidad de la madera, silenciando genes involucrados en la síntesis de lignina. Para la producción de papel, el pulping químico de la madera resulta ser un proceso sumamente costoso y agresivo para el medioambiente que consiste en separar la lignina de la celulosa y de la hemicelulosa (ver Cuaderno nº 76). La obtención de plantas con bajo contendido de lignina significa una reducción de costos y contaminación ambiental en la industria del papel. El silenciamiento de la última enzima en la ruta de biosíntesis de lignina (Pt4CL1) en álamos produjo árboles con una reducción del 45% en el contenido de lignina que fue compensado con un incremento en el nivel de celulosa del 15%.
Aplicaciones del silenciamiento génico en medicina
El descubrimiento del silenciamiento génico aumentó las esperanzas de obtener mejores tratamientos para variados desórdenes de salud, incluyendo infecciones virales, enfermedades cardiovasculares, cáncer y desordenes metabólicos. En ciertas enfermedades, algunos genes se expresan más de lo habitual. Por lo tanto, al silenciarlos, puede aliviarse el problema en cuestión.
Hasta el momento, no se ha aprobado ninguna droga basada en el mecanismo de silenciamiento génico para su comercialización ni para su uso en humanos. Sin embargo, se han llevado a cabo experimentos exitosos en animales, y muchas sustancias están siendo probadas en ensayos clínicos. Por ejemplo, se esta analizando la posibilidad de usar ARNdc como tratamiento para la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), que se trata de una enfermedad ocular en la que las áreas del centro del campo visual empiezan a perder nitidez. La DMAE se caracteriza por la formación de vasos sanguíneos anormales en la zona central de la retina, generada por la presencia de un factor de crecimiento endotelial vascular (VEFG). Al inyectar en el ojo ARNdc con la misma secuencia que el ARN mensajero que codifica para la proteína VEGF, se silencia el gen y, por ende, habría menor cantidad de VEGF. Esto podría prevenir la formación de capilares y el desarrollo de la enfermedad DMAE.
Se esta estudiando la posibilidad de aplicar el mecanismo de silenciamiento génico como método para combatir el virus RS, que causa infecciones respiratorias severas en niños pequeños. El principio del tratamiento consistiría en inhalar ARNdc de secuencias homólogas al virus, por lo que los virus en los pulmones serían inactivados y la infección controlada. Se ha llevado a cabo un estudio en humanos (voluntarios y saludables) y el tratamiento no mostró ningún efecto adverso serio.
También hay estudios de silenciamiento en animales y cultivos de células. En una investigación reciente en animales (roedores y monos), el uso de ARNdc resultó exitoso en el silenciamiento de genes involucrados en altos niveles de colesterol. Además se han llevado a cabo experimentos en células humanas, en los cuales se ha reducido la actividad del virus HIV del SIDA, por silenciamiento génico.
En resumen, en menos de 20 años ha habido un crecimiento exponencial en el entendimiento del proceso de silenciamiento génico. Se están investigando aplicaciones de este mecanismo natural en diferentes áreas: protección vegetal ante la infección de virus, modificaciones metabólicas en plantas que se traducen en mejores alimentos, árboles con maderas más aptas para la producción de papel, vacunas orales comestibles en plantas. Por último, pero no menos importante, se esta avanzando en desarrollos de aplicación del silenciamiento génico con fines terapéuticos en humanos.
